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过去大量研究已经证实，细胞外基质（ECM）刚度会影响细胞进程，包括扩散、生长、增殖、迁移、分化和类器官形成。

骨髓间充质干细胞（BMMSCs）位于具有可变基质刚度的复杂生态位中，影响不同干细胞的命运。然而，刚度如何驱动使干细胞命运改变仍然未知。来自北京大学团队阐明不同刚度细胞外基质（ECM）中干细胞转录和代谢信号的复杂相互作用，并提出了参与干细胞命运决定的潜在机制。结果表明，39~45kPa（硬）和7~10kPa（软）甲基丙烯酰化明胶水凝胶培养条件培养基对BMMSCs分化有不同的影响，高刚度ECM促成骨增加，低刚度ECM促成脂/软骨分化增强。

研究成果以“IntegrativeAnalysisRevealstheDiverseEffectsof3DStiffnessuponStemCellFate”为题发表在《InternationalJournalofMolecularScience》期刊。

本文亮点：

1.GelMA30/60/90为研究ECM刚度对干细胞命运的影响提供了有利的平台；

2.3DECM中进行体外和体内实验，确定干细胞命运决策过程中直接响应刚度变化的重要基因和途径；

3.较高ECM刚度下，氨酰基-tRNA的生物合成上调，成骨增加；

4.较高ECM刚度下，不饱和脂肪酸的生物合成和糖胺聚糖的沉积增加，BMMSCs的成脂/软骨分化增强。

GelMA水凝胶具有优异的生物相容性，为细胞增殖和分化提供了良好的3D结构。可通过改变水凝胶浓度来调整水凝胶刚度，这些水凝胶为研究ECM刚度对干细胞命运的影响提供了有利的平台。

图1GelMA水凝胶的表征

使用具有三种不同刚度（GM30，GM60和GM90）的GelMA支架在体外培养BMMSC，并在7天后进行RNA-seq检测。结果表明，随着刚度变化，3D培养细胞呈现不同的趋势，观察到成骨、成脂和软骨分化。ECM刚度的升高，与成骨相关的DEGs增加，例如具有骨形态发生蛋白6（BMP6），Wnt家族成员10B（WNT10B），TGFB2，扭曲家族基本螺旋-环-螺旋转录因子1（TWIST1），胰岛素样生长因子1（IGF1）和转化生长因子β受体3样（TGFBR3L），BMMSCs的成骨能力增强，而BMMSCs的成骨和成脂分化减弱。当基质刚度较低时，包括WNT2B、肌细胞增强因子5C（MEF2C）、COL2A2和基质金属蛋白酶1（MMP9）在内的成软骨相关基因的表达增加。

图27天后在不同刚度的ECM中培养的BMMSCs的转录组变化

图3与ECM刚度相关的代谢物集富集分析和代谢途径分析

为了验证不同ECM刚度对干细胞命运的作用，进行了ALP染色、阿利新蓝染色和油红O染色，以测试BMMSC在低、中和高刚度ECM中的成骨，软骨和成脂分化。BMMSC在水凝胶中3D培养7天，ALP染色和活性表明，随着ECM刚度的升高，成骨分化增强；14天后，阿利新蓝染色表明MSCs的软骨分化在低刚度组中最高，其次是中等组，然后是高刚度组；在PM和成脂培养基（AM）中培养21天后，用油红O染色验证ECM刚度对成脂分化的作用。结果表明，低刚度组比中组形成更多的脂肪滴，在高刚度组中，几乎没有脂肪滴形成。

图4ECM刚度对体外干细胞命运的影响

为了研究ECM刚度在骨愈合过程中的功能，采用体内大鼠模型评估30周时的骨愈合程度。将间充质干细胞植入GM30/60/90至股骨远端。八周后，使用显微CT扫描股骨。显微CT图像显示，植入高刚度组的大鼠体内形成的骨样组织最多，而在低刚度组中，观察到的骨形成最少。

图5体内骨愈合过程中3DECM刚度的作用

干细胞命运调控过程中的生物过程复杂，很难从单细胞组学中全面了解这一错综复杂的生理过程的调控机制。在这项研究中，作者系统的研究了不同刚度的ECM中的基因和代谢谱以及干细胞的命运。结合分析转录组学和代谢组学结果，过滤关键基因、代谢产物和代谢途径，全面解释干细胞命运的调控。此外，在ECM中进行体外和体内实验，以验证干细胞命运决策过程中直接响应刚度变化的重要基因和途径。总体而言，此项研究从代谢角度理解ECM刚度在改变干细胞命运中的调节作用提供了新思路。

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