THP-1细胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液，有分化为多种巨噬细胞的能力，是各领域研究常用的细胞系之一。

|细胞复苏

1.预热水浴锅至37℃

2.准备一个15mL离心管，加入2-3mL左右完全培养基待用

3.将细胞从-80℃冰箱或液氮中取出后，放进一次性PE手套中，立即投入水浴锅，迅速用力摇晃管子，使其1分钟内融化

4.酒精擦拭冻存管，进入生物安全柜，把融化的细胞悬液缓慢滴加到步骤2准备好的离心管中

5.1200rpm（约250g）离心3分钟

6.同时准备1个新的T25培养瓶，加入5mL完全培养基

7.去上清，新鲜培养基重悬细胞后滴加到步骤6的培养瓶里，放入培养箱

小贴士：THP-1细胞复苏后通常需要3-5天恢复状态，建议复苏后48小时内不要进行操作。

|细胞冻存

1.预先配制好冻存液

【推荐海星HyCyte™一步冻存液(即用型、无血清、无需程序降温)】

2.细胞1200rpm（约250g）3分钟离心后

3.去上清，用配好的冻存液重悬细胞

4.转移入冻存管

5.冻存管放进程序冻存盒

6.冻存盒放进-80度冰箱过夜，再放液氮长期保存

小贴士：由于THP-1是悬浮细胞，更易受到冻存影响，建议加大冻存密度，大约200万-300万/mL为宜，以提高复苏存活率。

|培养条件

培养基：RPMI-1640+10%FBS+0.05mMβ-mercaptoethanol+1%P/S

推荐传代比例：1:3-1:6，每2-3天换液一次

培养条件：气相：95%空气+5%CO2，温度：37℃

|传代操作

当细胞密度达到约8x10^5cells/ml左右时，即可进行传代。由于是悬浮细胞，可直接将细胞吸出，离心之后传代。传代最少浓度不应少于1x10^5cells/ml。

去掉培养皿中的培养基，加入PBS进行冲洗，并去上清;

加入胰酶进行润洗，并去上清;

放入CO2培养箱消化2-4min;

加入完全培养基终止消化，并吹打均匀。

|常见问题

1.收货时细胞出现伪足，或是碎片较多怎么办？

受到运输影响，悬浮细胞会短暂性出现形态改变的现象，如伪足等。通过传代培养，1周左右可以恢复正常。一些细胞在运输途中死亡而产生碎片，通过传代离心可以去除（见上文传代篇）。

2.培养过程中细胞发生贴壁怎么办？

少量细胞贴壁属于正常情况，将细胞悬液转移至新瓶中即可。当贴壁细胞的比例高于20%，说明细胞生长环境有异常，需排查培养箱设置、培养基成分，以及培养器皿是否异常。

3.培养过程中细胞发生聚团怎么办？

少量细胞聚团，呈葡萄串状，属于正常现象，特别是细胞密度较低时，易出现这种情况。更换血清品牌或增大血清比例（不超过20%）有助于解决聚团问题。不建议将聚团的细胞吹散，等待密度高时，会自己分散开。

4.培养基里一定要加β-巯基乙醇吗？

β-巯基乙醇是一种常用的培养补充剂，有抗氧化的作用，可减少氧化应激对THP-1细胞的影响。当细胞密度过大但需要维持时，可适当增加巯基乙醇的比例（不超过标准量的1.5倍）。

5.镜下观察时，难以聚焦或估算密度怎么办？

悬浮细胞会随着液体流动，不容易聚焦，静置5-10分钟使细胞沉底，之后在轻轻放上显微镜观察，将有助于聚焦和估算细胞密度。

|注意事项

1.细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上105到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。

3.注意细胞的密度一定要高，介于5×10^5——10^6/mL之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基严重泛黄，细胞数会增加。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。

4.THP-1细胞适合在细胞Ph环境偏酸性环境生长，对培养基变化非常敏感，所以尽量使用相同Ph的1640。

5.传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后3～4天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增;1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好;2）不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次（只是补充培养基）3）使用1640（ATCC推荐），注意加碳酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱;4）注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存。

6.复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的。

作者：海星生物
公众号：Cas9X细胞基因敲除
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